۲-۵-۱- کاربرد نشانگرهای RAPD در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی

پایه و اساس تنوع ژنتیکی در یک گونه تغییرات جهشی است که با ایجاد آلل های مختلف، اشکال فنوتیپی و ژنوتیپی متفاوتی را بوجود آورده است. به عبارت دیگر یکسان نبودن جایگاهای شناسایی آغازگر و همچنین جهش نقطه ای باعث از بین رفتن جایگاه های اتصال آغازگر شده و تنوع بوجود می آید. نشانگر RAPD، انگشت نگاری DNA در چندین جایگاه ژن را امکان پذیر می سازند در حالیکه نشانگر های پروتئینی تنها یک جایگاه ژنی را تحت شعاع قرار می دهد (وایوگ و پاول^[۸۶]، ۱۹۹۲). تکنیک RAPD برای انگشت نگاری ژنتیکی مناسب بوده بخاطر اینکه سریع می باشد) گواناما^[۸۷] و همکاران، ۲۰۰۰)، و به DNA اندکی نیاز می باشد (لوو^[۸۸] و همکاران، ۱۹۹۶). از سال ۱۹۹۶ تعدادی از نشانگرهای مولکولی– ژنتیکی جهت تعیین ساختار ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفت، در این میان RAPD که استفاده از آن آسان می باشد چون عملکرد اطلاعاتی در تعداد زیادی جایگاه ژنی^[۸۹] وجود دارد. نشانگرهای RAPD یکی از تکنیک های مورد استفاده در مطالعات ژنتیکی جمعیت های گیاهی به شمار می آید (نایبوم و بارتیش^[۹۰]، ۲۰۰۳).

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

ویرا^[۹۱] و همکاران (۲۰۰۱) به مطالعه تنوع ژنتیکی بر اساس ترکیب شیمیایی اسانس، فلاونوئیدها و نشانگرهای RAPD در ۱۲ جمعیت ریحان (Ocimum gratissimum) پرداختند، در این مطالعه گروهبندی بر اساس ترکیبات اسانس جمعیت های مورد مطالعه منجر به شناسایی شش تیپ شیمیایی مختلف گردید. از طرفی مطالعه و طبقه بندی ترکیبات فلاونوئیدی شش تیپ شیمیایی، نتایجی منطبق با آنچه در مورد ترکیبات اسانس مشاهده شد، ارائه نمود. در حالیکه کاربرد نشانگرهایRAPD، ۱۲ جمعیت ریحان را به سه گروه طبقه بندی کرد. این تفاوت بین نشانگرهای ژنتیکی و نشانگرهای شیمیایی به سهم متفاوت کنترل ژنتیکی و محیطی در ایجاد و بروز تیپ های شیمیایی بر می گردد.
اسکولا^[۹۲] و همکاران (۱۹۹۹) با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD، به منظور متمایز کردن دو جمعیت مریم گلی (Salvia fruticosa) به طور موفقیت آمیز استفاده کرده اند. همچنین از ترکیبات اسانس در تفسیر نتایج بهره یافته اند. گوناریس^[۹۳] و همکاران (۲۰۰۲) اطلاعات حاصل از آغازگرهای RAPD را به همراه نشانگرهای بیوشیمیایی همچون ترکیبات اسانس برای شناسایی گونه های مرزنگوشOriganum vulgare و O. onites و هیبرید Origanum x intercedens آن ها مورد استفاده قرار دادند.
نتایج روستایی و همکاران (۱۳۸۸) با بررسی تنوع ژنتیکی ۲۵ جمعیت از پنج منطقه مختلف جمع آوری شده از نشانگر RAPD استفاده شد که ۸۰ آغازگر استفاده شد که ۱۶ آغاز گر بیشترین چند شکلی را نشان دادند. اندازه باندها از ۲۵۰ تا ۲۵۰۰ جفت باز تفاوت داشتند آنالیز کلاستر نمونه های آویشن باغی و دنایی را در ضریب تشابه ۲۳/۰ به دو گروه مجزا تقسیم کرد و در بین نمونه های آویشن دنایی نمونه ها درضریب تشابه ۴۲/۰ به دو گروه تقسیم بندی شدند. سانگوان و همکاران (۱۹۹۹) با کاربرد ۱۰۱ نشانگرهای RAPD برای بررسی تنوع ژنتیکی آرتمیزیا به کار بردند و در جستجوی بوته هایی با میزان بالای تولید آرتمیزین در جمعیت ها بودند که ۹۷ نشانگر چند شکلی نشان دادند، تنوع ژنتیکی قابل توجهی در این توده وجود داشت که این تجزیه نشان می دهد بهبود ژنتیکی برای صفات شیمیایی امکان پذیر می باشد و روابط بین ارقام در مقیاس های مختلف ممکن است بررسی شود.
روستایی و همکاران (۱۳۸۸) با تجزیه ارتباطی بین صفات مورفولوژیکی و نشانگرهایRAPD در آویشن دنایی نشان داد که با بهره گرفتن از روش رگرسیون گام به گام بین ده صفت مورفولوژیکی با ۱۸۴ باند چند شکل RAPD، نشانگرهای مرتبط با هر صفت شناسایی شد با هر صفت چندین نشانگر همبستگی نشان داده نشانگرهای که بالاترین R² را داشت به عنوان موثرترین نشانگر برای آن صفت محسوب می شود. در مجموع از بین ده صفت بررسی شده بیشترین R² مربوط به ۱۵ نشانگر بود که با صفت تعداد گل آذین صددرصد همبستگی نشان داد.
به طور کلی RAPD به طور گسترده برای بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی از قبیل Viola pilosa (سونی و کائور^[۹۴]، ۲۰۱۴)، Myrraya koenigii L. (ورما و رانات^[۹۵]، ۲۰۱۳)، glabra Glycyrrhiza (مهروترا^[۹۶] و همکاران، ۲۰۱۲)، Artemisia herba alba(بدر^[۹۷] و همکاران، ۲۰۱۲)، )Rauvolfia tetraphylla فای سال^[۹۸] و همکاران، ۲۰۱۲)، Aloe vera L.راتوره^[۹۹] و همکاران، ۲۰۱۱)، Trigonella foenum-graecum (کاکانی^[۱۰۰] و همکاران، ۲۰۱۱ ) montanum Zingiber (بوا-این و پایسوک سانتی وانتانا^[۱۰۱]، ۲۰۱۰)، ، Ginkgo biloba L (لیاو^[۱۰۲] و همکاران، ۲۰۰۹ )، Taxus wallichiana (موهاپاترا^[۱۰۳] و همکاران، ۲۰۰۹)، Panax quinqefolius (لایم^[۱۰۴] و همکاران، ۲۰۰۷)، عناب^[۱۰۵] (سینگ^[۱۰۶] و همکاران، ۲۰۰۶)، گونه های نعناع (خانوجا^[۱۰۷] و همکاران،۲۰۰۰) و چاوان^[۱۰۸] و همکاران (۲۰۱۴) در گونه Ceropegia santapaui تاکنون استفاده شده است.

۲-۵-۲- کاربرد نشانگرهای AFLP در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی

کیونگ لی^[۱۰۹] و همکاران (۲۰۰۳) نشانگرهای AFLP را در مطالعه تنوع ژنتیکی توده های کشت شده و وحشی پریلا (Perilla frutescens) مورد استفاده قرار دادند. در مطالعه ای دیگر توسط نگی^[۱۱۰] و همکاران (۲۰۰۰) نیز به مطالعه تنوع و ارتباط ژنتیکی درون و بین گونه ای جنس پنیرباد^[۱۱۱] بوسیله نشانگرهای AFLP پرداختند. لابرا^[۱۱۲] و همکاران (۲۰۰۴) به مطالعه تنوع ژنتیکی ارقام ریحان (Ocimum basilicom) با بهره گرفتن از صفات مورفولوزیک، ترکیبات اسانس و نشانگرهای AFLP پرداختند. آن ها نتیجه گرفتند که آنالیز ترکیبی این نشانگرها روش مناسب برای تفکیک ژنوتیپ ها و ارتباط دادن ژنوتیپ انها با صفات زراعی می باشد. گلتا^[۱۱۳] و همکاران (۲۰۰۵) تنوع ژنتیکی ۳۹ ژنوتیپ فلفل دلمه ای را با نشانگرهای مورفولوژیک و AFLP ارزیابی نمودند. در این مطالعه همبستگی مثبت و معنی دار بین نشانگرهای AFLP و مورفولوژیک در تفکیک ژنوتیپ ها گزارش شده است. تلفیق اطلاعات مولکولی و فیتوشیمیایی برای تشخیص جمعیت ها روش مطلوب در مورد گیاهان دارویی می باشد و همچنین برخی تحقیقات در دهه اخیر که موید اهمیت نشانگرهای AFLP در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی هستند عبارتند از: داتوره (ماسی^[۱۱۴] و همکاران، ۱۹۹۹ )، خشخاشPapaver bracteatum )کارولان^[۱۱۵] و همکاران، ۲۰۰۲)، Solanum nigrum (جاکوبای^[۱۱۶] و همکاران، ۲۰۰۳)، Echinacea purpurea (عزیز و سایو^[۱۱۷]، ۲۰۰۸)، Taxus wallichiana (موهاپاترا^[۱۱۸] و همکاران، ۲۰۰۹)، Carthamus tinctorius (ژانگ^[۱۱۹] و همکاران، ۲۰۰۹)، Echinacea tennesseensis (موراءس^[۱۲۰] و همکاران، ۲۰۱۱)، Valeriana jatamansi (راج کومار^[۱۲۱] و همکاران، ۲۰۱۱).

۲-۵-۳- نشانگرهای ISSR

۲-۵-۳-۱- PCR آغازگرهای ریزماهواره ای قلاب شده ^[۱۲۲](AMP- PCR) یا تکثیر بین SSR^[123] (ISA یا ISSR) یا PCR بین ریزو ماهواره^[۱۲۴] (IM-PCR)

به منظور بهبود اختصاصی بودن آغازگر SSR در واکنش های AMP- PCR و به منظور به کارگیری آغازگرهای با پایه دو نوکلیوتیدی برای انگشت نگاری DNA، روش هایی ایجاد شده است که از آغازگرهای SSR تغییر یافته با ردیف های غیر تکرار شوند (به صورت قلاب شده در انتهای ‘۳ یا انتهای ۵’) استفاده می کند. در این روش از تکرار های دوتایی یا سه تایی نشاندار شده با موادپرتوزا که در یکی از انتها ها با دو یا چهار نوکلئوتید قلاب (لنگر) شده اند، به عنوان اغازگرهای تکی PCR استفاده می شود. محصولات تکثیر شده از طریق پرتو نگاری قابل مشاهده خواهند بود. در این روش فقط بخشی از نواحی که توسط AMP- PCR قابل تکثیر بوده اند؛ تکثیر می شوند. از این رو تکرار پذیری این روش نسبت به روش AMP- PCR بیشتر است. یکی از نخستین مثال های استفاده از اغازگرهای قلاب شده با ردیف تکراری ساده، اولین رشته ساختگی cDNA با اغازگرهای الیگو d (T)است که یک یا دو باز غیر T را در انتهای ‘۳ دارا است، در برخی موارد جایگاه های ‘۳ به صورت دژنره^[۱۲۵] و در برخی جایگاه ها به صورت غیر دژنره^[۱۲۶] هستند (نقوی و همکاران، ۱۳۸۸).
ناحیه قلاب شده اغازگر، اجازه اتصال محکم تر اغازگر به جایگاه هدف در نمونه الگو را می دهد. بنابراین اغازگر شانس بسیار کمی برای سرخوردن^[۱۲۷] خواهد داشت. این مورد به ویژه برای اغازگری دو نوکلیوتیدی تکراری به منظور کاهش سرخوردن و در نتیجه هیدروژنیسیتی مفید خواهد بود. این روش، با نام های مختلفی از جمله AMP- PCR، پی.سی.ار بین ریزماهواره IM-PCR)) با تکثیر بین اس.اس.ار(ISA) خوانده می شود که نخستین بار توسط می یر^[۱۲۸] و همکاران (۱۹۹۳) مطرح گردید.
تکثیر بین اس.اس.ار (ISA) بیانگر انگشت نگاری DNA با بهره گرفتن از اغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ‘۳ یا ‘۵ به منظور تکثیر دی.ان.ای بین نواحی SSR است. در برخی موارد محصول بدست امده از اغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ۳’ متفاوت از اغازگرهای SSR قلاب شده در انتهای ‘۵ است. در حقیقت فقط اغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ قادر به شناسایی تنوع اللی در داخل SSR هدف هستند. اغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ در مرز بالا دست SSR هدف قرار می گیرند و به سمت پایین دست حرکت می کنند. بنابراین محصولات بدست آمده از اغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ چندشکلی های بیشتری را نشان خواهند داد. بزرگترین محدودیت این روش این است که چند شکلی فقط مربوط به جایگاه هایSSR هایی است که با فاصله مناسب در دو جهت معکوس قرار گرفته باشد. از این رو یک SSR تکی در ژنوم از طریق این نشانگر قابل اشکار سازی نخواهد بود. همچنین در استفاده از اغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۳، امکان شناسایی هر گونه تنوع اللی در داخل SSR هدف نخواهد بود. با وجود این در استفاده از اغازگرهای قلاب شده در انتهای ‘۵ مشکلات اختصاصی بودن اغازگر وجود خواهد داشت ( نقوی و همکاران، ۱۳۸۸).

۲-۵-۳-۲- کاربرد ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی

ISSR نشانگر چند جایگاه اختیاری است که علاوه بر داشتن این خصوصیات، محدودیت نشانگرهای دیگر مثل تکرارپذیری کم در RAPD، هزینه بالا و سختی کار در AFLP را نداشته و به طور گسترده در سراسر ژنوم پراکنده است ( هان^[۱۲۹] و همکاران، ۲۰۰۷). نشانگرهای ISSR تکرارهای ریزماهواره چهار تا ۱۲ واحدی هستند که از یک انتهای شان دو تا چهار نوکلئوتید اختیاری دارند. آغازگرهای فوق امکان تکثیر قطعاتی از DNA را فراهم می آورند که بین دو ریزماهواره قرار داشته و به اندازه کافی به هم نزدیک هستند ( پروست و ویلکینسون^[۱۳۰]، ۱۹۹۹)، وراثت پذیری بالای جایگاه های ISSR، توزیع گسترده آن ها در ساسر ژنوم، شباهت آن ها به وراثت مندلی، تکرارپذیری بالا، عدم نیاز به اطلاعات قبلی در مورد ژنوم سبب استفاده روزافزون این نشانگر شده است. ISSR ها به خاطر طول بلند آغازگرهای آن اجازه انتخاب دمای واسرشته سازی بالاتری را می دهد، که دارای تکرارپذیری بیشتری است. این نشانگر معمولا به عنوان نشانگرهای غالب در نظر گرفته می شود (گوپتا و وارشنی^[۱۳۱]، ۲۰۰۰؛ سیک^[۱۳۲] و همکاران، ۲۰۰۸)، ولی در تشخیص و مطالعات هموزیگوت ها از هتروزگوت ها به عنوان نشانگر همبارز دسته بندی می شود (پروست و ویلکینسون، ۱۹۹۹؛ تسومورا^[۱۳۳] و همکاران، ۱۹۹۶). ISSR ها انگشت نگاری هایی با چند شکلی بالا تولید می کنند ( روبیو- مورگا^[۱۳۴] و همکاران، ۲۰۱۰).
نشانگر ISSR یکی از مهمترین نشانگرهای DNA می باشد که در دهه گذشته به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت های طبیعی استفاده شده است. در داخل خانواده نعناع، تکنیک ISSR برای بررسی تنوع ژنتیکی در درون و در میان جمعیت گونه های Artemisia capillaries (شافای^[۱۳۵] و همکاران، ۲۰۰۹)، Salvia miltiorrhiza (سونگ^[۱۳۶]و همکاران، ۲۰۱۰)، Stachys sp(کوشیوا^[۱۳۷]و همکاران، ۲۰۰۶)، Hesperozygis ringens (فارکارو و اچیورگارای، ۲۰۰۶)، و Lamiophlomis rotata (لیو و همکاران، ۲۰۰۶) مورد استفاده قرار گرفته است.
روابط ژنتیکی ۲۱ جمعیت از گونه T. caespititius جمع آوری شده از فلوریس^[۱۳۸]، سایو جورگی^[۱۳۹]، تریسرا^[۱۴۰] و گارسیوسا ^[۱۴۱]در شمال سرزمین پرتغال با روش مولکولی با بهره گرفتن از ۱۰ آغازگر ISSR بررسی گردید که در مجموع ۱۷۶ باند چند شکل تولید شد. براساس الگوهای ISSR، افراد به چهار خوشه جداگانه تقسیم شدند (لیما^[۱۴۲] و همکاران، ۲۰۰۹).
در بررسی تنوع ژنتیکی ۳۱ تک بوته T. caespititus جمع آوری شده از سه منطقه کوروا^[۱۴۳]، فلوری سرا گارسیوسا با بهره گرفتن از ۱۱ آغازگر ISSR و ۱۷ آغازگر RAPD بترتیب ۱۲۷ و ۱۹۹ باند چند شکل تولید شد. اطلاعات بدست آمده گیاهان جمع شده از مناطق کوروا و فلوری سرا در گروه جداگانه ای از گیاهان جمع شده از منطقه گارسی وسا قرارداد (تریندادی^[۱۴۴] و همکاران، ۲۰۰۹).
بررسی تنوع ژنتیکی و تمایز جغرافیایی ۱۷ توده آویشن دنایی (T. daenensis subsp. daenensis) با بهره گرفتن از ۱۵ آغازگر ISSR مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق ۲۵۶ باند تولید گردید که تعداد ۲۲۸ باند چند شکل بودند. دندروگرام تولید شده از داده ها، توده های بررسی شده را در دو گروه ژنتیکی متمایز قرار داد و انشعاب ژنتیکی آن ها ارتباطی قوی با مناطق جغرافیایی و رویشگاهی آن ها نشان داد (رحیم ملک^[۱۴۵] و همکاران، ۲۰۰۹).
فرج پور و همکارن (۱۳۸۸) با بررسی تنوع ژنتیکی Achilla با نشانگرهای ISSR و RAPD نشان دادند که دندروگرام آن ها را به پنج گروه تقسیم بندی کرد و تا حد زیادی الگوی توزیع منطقه ای را پوشش داد. بیکی و همکاران (۱۳۹۲) با بررسی تنوع وراثتی ۱۶ رقم زراعی و گونه های خودرو جنس زعفران (Crocus) با کاربرد ۱۴ نشانگر ISSR ارزیابی کردند که نتایج نشان داد که ۲۰۸ باند پلی مورفیسم تولید شد که نژادگان زعفران را در پنج گروه طبقه بندی کرد. همچنین نتایج PCOA همسو با گروهبندی بود نتایج فوق سودمندی بالای نشانگرهای ISSR را برای تفکیک و روابط ژنتیکی زعفران بیان می کند. کومار^[۱۴۶] و همکاران (۲۰۱۴) با بررسی تنوع ژنتیکی گیاه دارویی Justicia adhatoda با ۱۸ نشانگر RAPD و ۲۰ آغازگر ISSR نشان دادند که در مجموع ۴۳۲ باند تولید شد که ۴۰۴ باند چند شکل بودند.

۲-۶- سایر کاربردهای نشانگرهای مولکولی در گیاهان دارویی

۲-۶-۱- شناسایی و تایید^[۱۴۷] مواد گیاهی

تایید گونه گیاهی و حتی تیپ شیمیایی آن در فرایند کنترل کیفی مواد خام و عصاره های گیاهی از اهمیت زیادی برخودار می باشد. تقلب یا اشتباه غیر عمدی در تهیه مواد اولیه گیاهان دارویی به ویژه در داروهای سنتی که در برگیرنده چندین گیاه مختلف هستند یا محصولات گیاهی مشخص که به عنوان مکمل های غذایی استفاده می شوند و ضرورتا کنترل کیفی و ایمنی دقیقی روی آن ها صورت نمی گیرد، می تواند مشکلی اساسی در بسیاری از مواقع باشد. مثال بارز از چنین اشتباهات یا تقلبات گونه های دارویی پرفروش جینسینگ می باشد( شاو^[۱۴۸] و همکاران، ۲۰۰۰؛ ۱۹۹۸؛ ۱۹۹۵).
در تولید گیاهان دارویی کنترل کیفیت در دو سطح مورد توجه قرار می گیرد. شناسایی تاکسنومیکی مواد اولیه و پیش بینی درست و استاندارد سازی غلظت مواد فعال فیتوشیمیایی، این دو جنبه به طور کامل به یکدیگر مرتبط هستند زیرا تعداد زیادی از گونه های مهم دارویی کاملا ناهمگن هستند و از نظر نوع و درصد ترکیبات فیتوشیمیایی متفاوتند( بائوم و همکاران، ۲۰۰۱). برای مثال کاربرد مواد گیاهی دارویی جمع اوری شده بومادران برگ میله ای( Achilla mileffolium) از مزرعه با این انتظار که مواد مذکور متعلق به یک گونه اند و از نظر ترکیبات مهم دارویی چون آزولن ها، فلاونوئیدها و اسانس ها همگن هستند، عملا به علت اختلاط گونه های خیلی نزدیک به هم که شناسایی شان در مزرعه به راحتی امکان پذیر نیست، با مشکلاتی مواجه می شود( والنر و همکاران، ۱۹۹۶). به منظور جلوگیری از تنوع ناخواسته در کارایی تولیدات تجاری گیاهان دارویی نه تنها تایید صحیح گونه، بلکه حتی تمایز کامل بین لاین های اصلاحی، ارقام و یا توده های هم از اهمیت زیادی برخوردار است. به طور سنتی شناسایی گیاهان دارویی بر اساس خصوصیات فنوتیپی همانند مورفولوژی، بو، طعم، رنگ، بافت و اندازه بوده است. ولی این اختصاصات دارای محدودیت های مشخصی از جمله تنوع ناکافی در بین نمونه ها، وابسته به شخص بودن آنالیز، تغییر خصوصیات مورد ارزیابی تحت تاثیر عوامل محیطی و مدیریتی و وابسته بودن سنجش برخی از صفات در مراحل رشدی مختلف که ممکن است ضرورتا منطبق با مرحله نموی مطلوب اندام مورد استفاده از نظر تجاری هستند.
در سال های اخیر روش های متعدد فیتوشیمیایی از جمله HPLC و MS و نیز روش های مولکولی برای آنالیز و شناسایی مواد گیاهی مورد استفاده قرار گرفته اند. تکنیک های مولکولی بسته به گونه گیاهی و ناحیه ژنومی مورد مطالعه از کارایی متفاوتی برخوردار می باشند(نایبوم و ویسینگ، ۲۰۰۷).
شناسایی گونه های دارویی به ویژه زمانی که گونه های خیلی نزدیک با هم مقایسه شوند به راحتی امکان پذیر نیست. در تحقیقی توسط نگان^[۱۴۹] و همکاران (۱۹۹۹) تلاش کردند تا با بهره گرفتن از تجزیه توالی DNA ژن ۵, ۸ S rRNAریشه های متعلق به شش گونه جین سینگ را از یکدیگر و نیز از دو گونه مشابه معمول در تقلبات مواد گیاهی Phytolaca acinosa و Mirabilis jalapa متمایز کنند. اما میزان بالای همگنی توالی DNA این ناحیه در بین گونه های جین سینگ (۹۹%) همچنین سایر گونه های مرتبط مشاهده شد، در عوض با بهره گرفتن از توالی دو ناحیه جدا کننده داخلی امکان تمایز بهتر گونه ها وجود داشت و برای توسعه پروتکل شناسایی این گونه ها بر مبنای نشانگرهای RFLP مورد استفاده قرار گرفت. در مطالعه دیگر آرتیوکووا^[۱۵۰] و همکاران (۲۰۰۴) نمونه های مختلف تهیه شده جین سینگP. ginseng و P. quinquefolius از چین، کره، کانادا و امریکا را بااستفاده از نشانگرهای AFLP آنالیز کردند. یکی از باندهای AFLP که فقط در P. ginseng را تشخیص داده بود از ژل پلی آکریل آمید جدا شد و پس از کلون کردن، توالی یابی گردید و بر اساس توالی مینی ساتلایت موجود در این توالی پرایمری طراحی گردید که توانست به خوبی این دو گونه جین سینگ را از یکدیگر متمایز نماید.
لاوو^[۱۵۱] و همکاران (۲۰۰۱) توالی ناحیه STS را برای تمایز ۱۶ گونه متعلق به ارکیده های دندروبیوم و برخی گونه های مرتبط همانند فولیدوتا (Pholidota) مورد استفاده قرار دادند. در این مطالعه تایید گونه ها با وجود میزان پایین تنوع STS درون گونه ای به آسانی قابل انجام بود. در تحقیقی دیگر زانگ^[۱۵۲] و همکاران (۲۰۰۳) اطلاعات توالی STS را به منظور توسعه ریزآرایه DNA الیگونوکلئوتیدی مورد استفاده قرار دادند. توالی هدف با رنگ فلورسنت برچسب دار شده و حضور توالی هدف هیبرید شده بوسیله اسکنر لیزری کانونی تشخیص داده شد این ریزآرایه قادر به شناسایی پنج گونه دندروبیوم که دارای خواص دارویی هستند بود. همچنین قادر بود حضور گونه دندربیوم نوبیل Dendrobium nobile را در فرمولاسیون دارویی حاوی نه گیاه مختلف تشخیص دهد.
روش شناسایی گونه مبتنی بر ریزآرایه DNA همچنین بوسیله کارلز^[۱۵۳] و همکاران (۲۰۰۵) مورد استفاده قرار گرفت. این محققین تراشه سیلیکونی را طراحی کردند که قادر بود بین ۲۰ گونه رایج و سمی تاتوره مورد استفاده در طب سنتی چین تمایز ایجاد کند. کاوشگر های ثابت شده روی تراشه بر اساس توالی ژن ۵SrRNA و در دو مورد بر اساس توالی ژن RNA ناقل اختصاصی لئوسین طراحی شده بودند. در این روش حتی دو گونه خیلی نزدیک گیاه تاتوره (Daturea inoxia و D. metel) از خانواده سیب زمینی علی رغم تفاوت دو نوکلئوتید از یکدیگر متمایز شدند.
خانوجا^[۱۵۴] (۲۰۰۰) نشانگرهای RAPD را برای شناسایی گونه های نعناع مورد استفاده قرار داد این مطالعه نشان داد که رقم کارویانا از گونه نعناع (Mentha gracilis) ممکن است که از هیبریداسیون طبیعی بین گونه نعناع (M. arvensis L.) و گونه نعناع (M. spicata) مشتق شده استف علاوه بر این آن ها با برخی از پرایمرهای RAPD توانستند باندهای اختصاصی گونه شناسایی کنند که می تواند برای شناسایی و تایید گونه های نعناع مورد استفاده قرار گیرند، همچنین شاسانی^[۱۵۵] و همکاران (۲۰۰۵) نشانگرهای RAPD و AFLP را به صورت هدفمند برای شناسایی هیبرید های بین و درون گونه ای نعناع به عنوان هدفی در برنامه های تلاقی توسعه دادند.
در بسیاری از موارد، ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی مواد گیاهی که از آنها نمونه هایی برای تایید گرفته شده، ضرورت دارد که نشانگرهای مبتنی بر توالی DNA با تکامل آهسته^[۱۵۶] برای بررسی حوادث تاریخی در دور زمانی طولانی تر، کافی هستند در حالیکه نشانگرهای منشاء گرفته از توالی های با تکامل سریع برای آنالیز جمعیت هایی که اخیرا متمایز شده اند مناسب ترند. برای واحدهای متنوع، برای مثال جمعیت ها یا توده ها در گونه های متنوع و دگربارور، ممکن است نیاز باشد که از تعداد زیادی نمونه برای آنالیز استفاده شود و یا اینکه برای هر نمونه تعداد زیادی از نشانگرها آنالیز شوند ( نایبوم و ویسینگ، ۲۰۰۷).
گیلمور^[۱۵۷] و همکاران (۲۰۰۳) کارایی نشانگرهای میکروساتلایت را برای شاهدانه در مطالعات جرم شناسی مورد بررسی قرار دادند. بر اساس تجزیه واریانس مولکولی بین دو گروه اصلی شاهدانه، ۲۵ درصد از کل تنوع ژنتیکی مربوط به انواعی است که برای تولید فیبر استفاده می شوند و شش درصد مربوط به آن هایی که برای تولید دارو استفاده می شوند. این نتایج نشان داد که انگشت نگاری DNA با بهره گرفتن از میکروساتلایت ها می تواند در تعیین تیپ زراعی، منشاء جغرافیایی و محل تولید این محصولات دارویی تکثیر شده به صورت کلون، کمک نماید. ولی بین الگوی روابط بین توده های مختلف از یک طرف و میزان تتراهیدروکامابینول از طرف دیگر هماهنگی یافت نشد.

۲-۶-۲- نشانمند کردن ژن ها و انتخاب به کمک نشانگر همراه

اصلاح گیاهان دارویی منجر به افزایش عملکرد و بهبود کیفیت محصول نهایی می گردد. در این زمینه یکی از مهمترین کاربردهای نشانگرهای مولکولی توسعه نشانگر قابل تشخیص آسان و دارای پیوستگی ژنتیکی با صفت مورد علاقه می باشد. چنین نشانگرهایی می توانند در برنامه اصلاحی جهت انتخاب برای یک صفت خاص که به طور معمول بررسی آن هزینه بر یا وقت گیر است، استفاده شوند. در گیاهان دارویی و معطر، نشانگرهای مولکولی برای صفات شیمیایی (به ویژه نشانگرهای شناسایی کننده ژن های دخیل در مسیر بیوسنتز ترکیبات ثانویه مهم اقتصادی) می توانند جایگزین یا مکمل روش های تجزیه فیتوشیمیایی باشند. یکی از مزیت های خاص این نشانگرها قابلیت کاربرد آن ها در اصلاح و کنترل کیفیت در کل زنجیره تولید می باشد. انتخاب تیپ شیمیایی به کمک نشانگر همراه^[۱۵۸] در ردیابی ژن های وارد شده از گونه های وحشی به گونه های اهلی از طریق تلاقی طی برنامه اصلاحی تلاقی برگشتی از کاربردهای مهم دیگر چنین نشانگرهایی می باشد. برخلاف سایر نشانگرها، نشانگرهای مولکولی مستقل از تاثیرات محیطی و اپی ژنتیکی هستند و می توانند در مراحل اولیه رشد گیاه مورد بررسی قرار گیرند(نایبوم و ویسینگ، ۲۰۰۷).
با وجود اینکه روش های متنوع آنالیز فیتوشیمیایی با کارایی مناسب برای بسیاری از ترکیبات دارویی توسعه یافته اند اما در زمینه کاربرد نشانگرهای مولکولی در تشخیص تیپ های شیمیایی منابع بسیار محدود است. واگنر و همکاران (۲۰۰۴) توانستند با بررسی مولکولی توارث کامازولن و بیزابولوئیدها در ژنوتیپ های بابونه با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD و AFLP، نشانگرهای مولکولی پیوسته با این ترکیبات را شناسایی کنند که در برنامه اصلاحی مورد استفاده قرار گیرد. باسیفیکو و همکاران (۲۰۰۶) با بهره گرفتن از نشانگرهای مولکولی توانستند تیپ های مختلف هیدروکانابینول را در شاهدانه متمایز نمایند که هم در برنامه های اصلاحی و هم در زمینه های جرم شناسی مفید می باشد. مثال دیگر در این مورد توسعه نشانگرهای مولکولی برای عطر برنج است که توسط برادبیری و همکاران (۲۰۰۵) انجام شده است. عطر برنج به علت حذف هشت جفت باز و چند شکلی در سه نوکلئوتید در زن کد کننده بتائین آلدئید هیدروزناز-۲، ایجاد می شود. نشانگر DNA توسعه یافته برای تشخیص برنج معطر از غیر معطر می تواند جهت غربالگری با کارایی بالا استفاده شود.
ایجاد نقشه های لینکاژی یکی از مهمترین کاربرد های نشانگرهای DNA است. چنین نقشه هایی به نوبه خود برای آشکار سازی ژنتیکی صفات پیچیده و برای مکان یابی و کلون کردن ژن ها بسیار مفید هستند. نقشه های ژنتیکی لینکازی بوسیله انواع متعدد نشانگرهای مولکولی برای برخی گیاهان دارویی از جمله سرخدار و سیر ایجاد شده است. در مورد سرخدار ۴۱ باند از ۱۰۲ باند RAPD در ۱۷ گروه لینکازی پراکنده بودند( گوسمن و همکاران، ۱۹۹۶). در سیر SNP، SSR و RAPD برای تعیین هشت گروه لینکاژی مورد استفاده قرار گرفتند. یکی از هشت گروه لینکازی همچنین شامل یک مکان ژنی برای نرباروری بود.(زادودی و همکاران، ۲۰۰۵) در مطالعه دیگری روی سیر ۲۱۶ و ۱۴۳ نشانگر AFLP به ترتیب در دو جمعیت در حال تفرق نقشه یابی شدند (اپیک و همکاران، ۲۰۰۵). به علاوه نشانگر مختص ژن های آلیناز، کیتیناز، سوکروز، فروکتوزیل ترانسفراز و چالکون سیتاز می تواند در این نقشه قرار داده شود. بااوم و همکاران (۲۰۰۱) در روشی متفاوت برای نشانمند کردن ژن ها با هدف ایجاد نشانگر برای صفات با وراثت چند ژنی ۵۲ گیاه اکیناسه (Echinacea purpurea) را با ۲۳۲ نشانگر AFLP غربال کردند. این گیاهان همچنین از نظر میزان ماده موثره شیکوریک اسید و تتران با آنالیز HPLC مورد بررسی قرار گرفتند. آنالیز رگرسیون و همبستگی کانونیک برای بررسی روابط بین باندهای DNA و ترکیبات شیمیایی مورد استفاده قرار گرفت. که در نتیجه حدود ۲۲ باند DNA که می توانند برای پیش بینی های بعدی طیف فیتوشیمیایی گیاهان مورد استفاده قرار گیرند، در این آنالیز یافت شد.

۲-۶-۳- تعیین مکانیزم گرده افشانی و باروری

یکی از استفاده های دیگر نشانگرهای مولکولی، مطالعه سیستم گرده افشانی و باروری یک گونه گیاهی است که اغلب به همراه انالیز جمعیت انجام می شود. آگاهی از سیستم گرده افشانی و باروری، موضوع مهمی در اهلی کردن گیاهان دارویی و معطر است چرا که گونه های دارویی زیادی از رویشگاه طبیعی به مزرعه منتقل شده اند، بدون اینکه هر گونه اطلاعی از سیستم باروری آن ها داشته باشیم. در حالی که اطلاع از سیستم باروری برای اصلاحگران یک ضرورت مطلق است. برخی گونه های دارویی دارای سیستم باروری پیچیده هستند و نشانگرهای مولکولی به خوبی می توانند برای مطالعه این گیاهان مورد استفاده قرار گیرند. یک گونه گیاهی به نام اسکوت هندی به علت دارا بودن گل های کاسموگام و همچنین کلیستوگام روی یک پایه گیاه، بسیار جالب توجه است. سان و همکاران (۱۹۹۹) با بهره گرفتن از نشانگرهای RAPD نشان دادند که این گیاه غالبا از سیستم خود باروری برخوردار است. آرنولداشمیت (۲۰۰۰) نشانگرهای مولکولی RAPD را به منظور بررسی سیستم تولید مثلی گل راعی و تشخیص گیاهان حاصل از تولید مثل جنسی از آپومیکسی مورد استفاده قرار دادند.

فصل سوم

روش اجرای تحقیق

۳- ۱- بررسی های مورفولوژیکی

۳-۱-۱- مواد گیاهی

مواد گیاهی این مطالعه شامل ۱۵ جمعیت‎ آویشن کوهی متعلق به هفت استان ایران موجود در کلکسیون گیاهان دارویی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان مرکزی بودند که مورد ارزیابی قرار گرفتند (جدول۳ -۱). مشخصات کلکسیون با عرض جغرافیایی ۳۳ درجه و ۵۳ دقیقه شمالی و طول جغرافیایی ۵۰ درجه و ۲۹ دقیقه شرقی با ارتفاع از سطح دریا ۱۷۳۲ متر و دارای زمستان‌های سرد - مرطوب و تابستان‌های گرم و خشک می باشد.
در سال های ۱۳۹۰ الی ۱۳۹۳ آزمایش های مشاهده ای در خصوص جمع آوری اطلاعات صورت گرفت و در سال ۱۳۹۳ ضمن ارائه عملیات زراعی دقیق مانند آبیاری و کنترل علف های هرز، جمعیت های مختلف آویشن کوهی در زمان گلدهی از نظر صفات مورفولوژیکی کمی اندازه گیری، صفات کیفی به صورت مشاهده ای یادداشت برداری و برگ لازم جهت استخراج DNA برداشت گردید.

۳-۱-۲- ارزیابی صفات مورفولوژیک

اندازه گیری صفات کمی و کیفی به روش های متفاوت و مناسب هر یک انجام شد. برخی صفات به کمک وسایل آزمایشگاهی اندازه گیری و بعضی نیز بر اساس نمرهدهی^[۱۵۹] انجام شد.

۳-۱-۲-۱-صفات کمی

بر اساس فلورا ایرانیکا ۱۵ صفت کمی بوسیله کولیس دیجیتالی، دوربین دوچشمی و خط کش اندازه گیری شدند و برای هر صفت ۶-۴ بوته در نظر گرفته شد. صفات کمی در جدول ۳- ۲ ارائه شده است.
این مطالعه در قالب طرح بلوک‎های کامل تصادفی در سه تکرار و با ۱۵ تیمار (جمعیت های آویشن کوهی) انجام شد .تجزیه های آماری شامل محاسبه ضرایب همبستگی ساده، تجزیه به مولفه های اصلی به روش واریماکس و آزمون چند دامنه ای دانکن جهت مقایسه میانگین‏ استفاده شد. گروهبندی با مربع فاصله اقلیدسی و بر اساس روش UPGMA صورت گرفت. تجزیه داده های کمی با نرم افزار Excel , SPSS Ver 11.5 و TYSY Ver 2.02 انجام شد. گروهبندی و تمایز جمعیت ها با توجه به این ویژگی ها مورد بحث قرار گرفتند.